Kuidas kujundada PCR praimerit

Posted on
Autor: Peter Berry
Loomise Kuupäev: 12 August 2021
Värskenduse Kuupäev: 14 November 2024
Anonim
Kuidas kujundada PCR praimerit - Teadus
Kuidas kujundada PCR praimerit - Teadus

Wisconsini ülikooli BioWebi veebisaidi kohaselt on PCR praimer lühike sünteetiline oligonukleotiid (tavaliselt 18 kuni 25 alust pikk), mida kasutatakse DNA spetsiifiliste piirkondade amplifitseerimiseks molekulaarbioloogia tehnikas, mida nimetatakse polümeraasi ahelreaktsiooniks (PCR). Vaja on nii edasi kui ka vastupidist praimerit, mis on kavandatud DNA ahela pöördkomplementideks, külgnema ja seonduma soovitud DNA piirkonnaga. Kui teadlased soovivad teha uuringuid konkreetse geeni või DNA piirkonna kohta, peavad nad esmalt läbi viima PCR, et omandada piisavalt sihtpiirkonda, millega töötada. Vaadeldava piirkonna praimerijärjestuste kujundamine võib osutuda vajalikuks, kui need pole juba varem avaldatud uuringute või kommertslike vahendite kaudu kättesaadavad.


    Hankige huvipakkuva geeni või DNA piirkonna nukleotiidijärjestus ja otsustage, kui kaua fragmenti soovite amplifitseerida. Edasine ja tagurpidi praimer on kavandatud siduma soovitud fragmendi alguses ja lõpus. Tavaliselt kasutatakse tavapärastes PCR-meetodites praimereid, mis külgnevad 100–1000 aluspaari pikkuse piirkonnaga, reaalajas kasutatavate PCR-meetoditega aga umbes 50 kuni 200 aluspaari pikkuseid fragmente.

    Otsustage, millises järjestuses soovite praimerid valetada. Näiteks võiksite soovitada asukohta jada 5. või 3. otsa lähedal või keskel. Soovi korral määrake intronit katvate praimerite asukoht.

    Järgige praimeri kujundamisel soovitatud juhiseid. DNA produkti edukas amplifikatsioon sõltub praimerite kvaliteedist ja teatud muutujad on kriitilised.

    Kujundage praimerid pikkusega 18 kuni 24. Brinkmann Instruments Inc., Ph.D., doktor Vincent R. Prezioso soovitab, et see pikkus on piisavalt pikk, et olla soovitud DNA piirkonna jaoks äärmiselt spetsiifiline, kuid piisavalt lühike, et seda hõlpsalt siduda (anniilida). Praimeri sulamistemperatuur (Tm) peaks olema vahemikus 55–80 kraadi, piisavalt madal, et võimaldada täielikku sulamist 90 kraadi või üle selle, kuid piisavalt kõrge, et võimaldada lõõmutamist. GC sisaldus (Gs ja Cs protsent järjestuses) peaks olema vahemikus 40 kuni 60 protsenti. Praimerijärjestuse 3 ots peaks seondumise soodustamiseks lõppema C või G (nimetatakse GC klambriks), kuna G ja C nukleotiididel on tugevamad sidemed, vältige siiski, et viimasel viiel alusel oleks kolm või enam G või Cs jada.


    Vältige nelja või enama ühe aluse (nagu ACCCC ...) või nelja või enama di-nukleotiidi korduse (nagu ATATATAT ...) kasutamist, sest need võivad põhjustada ekslikku õpetust.Kujunduspraimerid, millel puudub praimerisisene homoloogia (rohkem kui kolm alust, mis täiendavad ühe praimeri enda sees) või praimeritevaheline homoloogia (kus esi- ja vastupidisel praimeril on komplementaarsed järjestused). See võib põhjustada ise-dimeere või praimeridimeere, kus praimerid seovad soovitud DNA järjestusega sidumise asemel iseendaga.

    Kasutage veebiressursse ja veebisaite, mis abistavad praimeri kujundamisel, või aitavad kontrollida praimerite järjestust ise täiendavuse või võimalike sekundaarstruktuuride nagu juuksenõelad moodustamise osas. Mõne praimeridisaini veebisaidil on Massachusettsi Tehnoloogiainstituut Primer3, Riiklik biotehnoloogiaalase teabe keskus Primer-Blast ja integreeritud DNA tehnoloogiad OligoAnalyzer.