Sisu
Geelelektroforeesis eraldatakse DNA või valkude proovid - tavaliselt suuruse alusel - elektrivälja abil, mis põhjustab nende migratsiooni läbi geeli. Geelelektroforeesi kasutamine on biomeditsiini uurimislaborites rutiinne ja seda kasutatakse mitmesugustele küsimustele vastamiseks, nii et pole olemas universaalset viisi tulemuste analüüsimiseks.
Erinevad tehnikad, näiteks Western blot, Northern blot ja Southern blot, hõlmavad kõik geelelektroforeesi.
Kui teete DNA-proovide agaroosgeeli elektroforeesi, peate kõige tavalisema protseduuri puhul tegema tavaliselt vähemalt kaks toimingut: 1) eristama lõikamata plasmiidid insertidest, nikitud plasmiididest ja tükeldatud plasmiididest ning 2) määrama erinevate DNA fragmendid standardkõveraga Excel või kalkulaator.
Heres kuidas see töötab.
Kontrollige labori märkmikku, et teha kindlaks, millised proovid millistele radadele laaditi. Geeli kaevude laadimisel oleksite pidanud märkima iga raja / proovi identiteedi.
Määrake, milline rada sisaldab DNA standardite "redelit". Need on teadaoleva pikkusega killud; nende rändekaugust saab kasutada proovifragmentide suuruse määramiseks, kasutades standardset kõverat Excel või mõni muu kalkulaator.
Mõõdetage joonlaua abil oma pildi kaugus süvenditest jälgimisvärvini, mis on liikunud kaugemale kui ükski DNA ribadest (teisisõnu, see asub geeli põhjas). Pange see number kirja - kasutatavad ühikud pole olulised.
Mõõtke oma pildil olev kaugus kaevudest iga "redeli" riba külge ja jagage see vahemaa jälgimisvärvi riba läbitud vahemaaga. See arvutus annab teile iga riba suhtelise liikuvuse.
Näide: Oletame, et jälgimisvärviriba liikus 6 tolli ja meil on kolm riba, mis liikusid 5, 4,5 ja 3,5 tolli.
Milline on nende suhteline liikuvus? Vastus: jagame 5, 4,5 ja 3,5 6-ga, et saada suhteline liikuvus 0,833, 0,75 ja 0,5833.
Sisestage arvutustabeliprogrammi suhteline mobiilsus (Excel või mõni muu samalaadne programm, mida kasutate) koos redeli iga fragmendi suurusega kilobaasides.
Tootja annab teile nende tarnitud redelite iga fragmendi suuruse, nii et teil peaks see teave juba olemas olema.
Joonistage suhtelise liikuvusega andmed x-i ja suurus kilobaasides y-le.
Kasutage arvutustabeliprogrammi funktsiooni Trendline, et andmetega võrrand sobitada. See võrrand peaks olema võimsusvõrrand (nt x ^ -2) ja see peaks andmeid suhteliselt hästi sobitama (R-koefitsient vähemalt 0,9). Nii luuakse kõver ja standardkõver Excel.
Vaadake oma proovidele vastavaid ribasid.
Pidage meeles, et väiksemad DNA fragmendid liiguvad geeli kaudu kaugemale kui suured DNA fragmendid, seega on jälgimisvärvile kõige lähemal olevad väikseimad. Pange aga tähele, et kui plasmiidne (ümmargune) DNA on lõikamata, muutub see "superkeerduvaks" või väändub nagu telefonikaabel, mis põhjustab selle liikumist kaugemale kui sama suurusega lineaarne DNA.
Samuti liigub mittetäielikult tükeldatud "nikitud" plasmiid a lühem vahemaa kui sama suurusega lineaarne DNA. Järelikult ei saa te geelist lõigamata plasmiidide suurust hinnata.
Pange iga sõiduriba ribad vastavusse sellele rajale laaditud prooviga ja määrake, kas see, mida näete, on see, mida oleksite oodanud. See sõltub teie katse iseloomust.
Üldiselt võib aga arvata, et kui seedite insertplasmiidi kahe restriktsiooniensüümiga, siis vabastatakse insert plasmiidist.
Kuna see on palju väiksem kui plasmiid, võite eeldada, et sellel rajal näete kahte riba: ühte ülaosa lähedal ja teist allapoole põhja lähedal. Ainult ühe restriktsiooniensüümiga lõigatud plasmiid peaks moodustama ainult ühe riba, mis liigub veidi kaugemale kui kahe restriktsiooniensüümiga lõigatud plasmiid, kuid mitte kusagil inserdi lähedal.
Mõõda kaugus kaevudest lõigatud plasmiidini ja sisesta ribad oma joonlauaga. Jagage need numbrid jälgimisvärvi läbitud vahemaaga, et leida vahetükkide ja lõigatud plasmiidide suhteline liikuvus.
Ühendage vahetükkide suhteline liikuvus ja lõigake plasmiidid arvutustabeliprogrammi teile arvutatud võrrandisse. See arvutus peaks andma teile hinnangu nende plasmiidide suuruse kohta.