Sisu
- Kuidas puhvrid töötavad?
- Puhvri nõuded
- Sobiva puhvri valimine
- Puhvri pH muutmine
- Bioloogiliste puhvrite näited
Rakkudes ja elusorganismides hoitakse rakkudes ümbritsevaid ja sees olevaid vedelikke püsival pH tasemel. Selle süsteemi pH on organismis toimuvate biokeemiliste reaktsioonide jaoks sageli ülioluline. Bioloogiliste protsesside uurimiseks laboris kasutavad teadlased puhvreid, et eksperimendi ajal säilitada õige pH. Paljusid bioloogilisi puhvreid kirjeldasid Good ja kolleegid algselt 1966. aastal ja neid kasutatakse tänapäevalgi laborites.
Kuidas puhvrid töötavad?
Puhver on lihtsalt lahus, mis sisaldab nõrka hapet ja selle konjugeeritud alust. Kui puhvrile lisatakse hapet, reageerib see konjugeeritud alusega, moodustades nõrga happe ja mõjutades lahuse pH-d vaevalt.
Puhvri nõuded
Bioloogiline puhver on efektiivne mitmete omaduste abil. Need peaksid olema vees lahustuvad, kuid mitte lahustuvad või vähe lahustuvad orgaanilistes lahustites. Puhver ei tohiks rakumembraanist läbi pääseda, kuna see võib mõjutada raku käitumist. Puhvrid peaksid olema mittetoksilised, ei tohiks absorbeerida ultraviolettkiirgust ning püsima inertsena ja stabiilsena kogu katseprotsessi vältel. Temperatuur ja iooniline koostis ei tohiks muuta pH-d ega puhverdusvõimet.
Sobiva puhvri valimine
Valitud puhvri pKa peaks olema uuritava protsessi jaoks optimaalses vahemikus. Kõrgema pKa-sisaldusega puhver on asjakohane, kui katse ajal võib tõenäoliselt tõusta pH, ja vastupidi, kui eeldatakse, et pH langeb. Puhvri kontsentratsioone tuleks optimeerida, kuna kontsentratsioonidel, mis on suuremad kui 25 mM, võib olla parem puhverdusvõime, kuid see võib pärssida rakkude aktiivsust, näiteks ensüüme. Meetod määrab ka selle, millist puhvrit kasutada; näiteks elektroforeesi korral on geeli maatriksi kuumenemise vältimiseks sobiv madala ioontugevusega puhver.
Puhvri pH muutmine
Kuna pH võib temperatuurimuutustega muutuda, peaksid teadlased katsetama puhvrite pH-d temperatuuril, mille jooksul nad katse läbi viivad. Tris on puhver, mis on eriti tundlik pH muutuse suhtes temperatuuriga. Kõik pH-meetrid tuleks kalibreerida töötemperatuuril. Lisandid võivad muuta ka pH taset, tehes vajaduse uuesti testimiseks. PH muutmiseks lisatakse hapet, tavaliselt vesinikkloriidhapet või alust, tavaliselt naatrium- või kaaliumhüdroksiidi; seda tuleks teha aeglaselt, et vältida puhvri inaktiveerimist või keemilisi muutusi.
Bioloogiliste puhvrite näited
TE-puhver, mis on 10 mM Tris-HCl ja 1 mM EDTA, on nukleiinhapete säilitamiseks asjakohane mitme pH väärtuse korral. Elektroforees on tavaline meetod valkude või nukleiinhapete uurimiseks; selles protsessis kasutatakse arvukalt puhvreid, sealhulgas Tris-atsetaat-EDTA, Tris-glütsiini ja Tris-boraat-EDTA puhvreid. Need puhvrid takistavad geelimaatriksi kuumutamist ja võivad sisaldada lisandeid nagu uurea ja SDS, sõltuvalt uuringust.