Sisu
Ensüümi poolt katalüüsitavates keemilistes reaktsioonides vähendab ensüüm vajalikku aktivatsioonienergia kogust, sidudes selle substraadiga ajutiselt ja keerates selle pinges olekusse. Reaktsiooni k (katalüsaator) või "kcat" tähistab kontsentratsioonist sõltumatut konstanti kiirusel, millega konkreetne ensüüm suudab substraadi metaboliseerida produkti molekuliks. Kcat arvutamiseks segavad teadlased esmalt mitu katseklaasi erineva kontsentratsiooniga substraadiga (tuntud kui "ensümaatiline test") ja testivad neid konstantsete ajavahemike järel kerge spektrofotomeetriga, et mõõta tootemolekulide kasvavaid kontsentratsioone. Seejärel kantakse need andmed graafikule ja analüüsitakse.
Algkiiruse arvutamine
Joonestatakse toote kontsentratsiooni diagramm ensüümianalüüside esimese katseklaasi andmete ajaga. Märkus: horisontaaltelg peaks olema aeg ja vertikaaltelg - toote kontsentratsioon.
Arvutage lineaarse regressioonisirge andmepunktide jaoks, mille olete joonistanud 1. jao 1. etapis. Ehkki Exceli ja graafiliste kalkulaatoritega saab selle lineaarse mudeli hõlpsalt kindlaks teha, saate regressioonisirgete kalde hinnangu tuletada, jagades toote kontsentratsiooni erinevuse külgnevate andmete vahel punkte nende erinevuse järgi aja järgi.
Registreeri lineaarse regressioonisirge kalle 1. jao etapist 2 kui "algne reaktsioonikiirus (Vo)". Märkus: regressioonijoone mudelis "= m + b" on koefitsient "m" kalle.
Korrake samme 1, 2 ja 3 ülejäänud katseklaaside korral analüüsis.
Vmax arvutamine
Joonistatakse iga katseklaasi substraadi kontsentratsiooni pöördvõrdeliselt selle algse reaktsioonikiiruse pöördväärtus (punktist 1, punkt 4). Näiteks kui katseklaasi algkiirus, mille substraadi algkontsentratsioon oli 50 mikromooli (uM), oli 80 uM / s, siis pöörded oleksid substraadi kontsentratsiooni korral 1/50 uM ja algse kiiruse korral 1/80 uM / s kiirus. Märkus: substraadi pöördvõrdeline kontsentratsioon peaks olema horisontaalteljel ja pöördvõrdeline algkiirus peaks olema vertikaalteljel.
Märkus: substraadi kontsentratsioon peaks olema horisontaalteljel ja reaktsiooni algkiirus peaks olema vertikaalteljel.
Määrake 2. jao 1. etapis joonistatud diagrammi jaoks lineaarne regressioonisirge. Märkus. Kuna peate teadma regressioonisirge y-ristmikku, peaksite punkti 2. jaotis 1 sisestama punktid kas Excelisse või graafikukalkulaatorit ja kasutage sisseehitatud regressioonimudelite funktsioone.
Jagage 1 lineaarse regressioonisirgega y-lõikega. See annab teile Vmax pöördväärtuse, ensüümi maksimaalse reaktsioonikiiruse väärtuse. Märkus: kui lineaarse regressioonimudeli kuju on "= m + b", siis on "b" väärtus y-ristmik. Jagage 1 väärtusega "b", et arvutada Vmax pöördväärtus.
Vmax tegeliku väärtuse arvutamiseks jagage 1 tulemusega 2. jao 3. toimingust.
Algses analüüsis määrake ensüümi kontsentratsioon (vt töötlemata andmeid). Märkus: ensüümi kontsentratsioon on kõigis katseklaasides sama; ainult substraadi kontsentratsioonid varieeruvad analüüsis.
Jagage Vmax (jaotisest 2, etapp 4) ensüümi kontsentratsiooniga (jaotisest 2, etapp 5). Tulemuseks on Kcat väärtus.