Sisu
- Elektroforeesil on piiratud proovianalüüs
- Elektroforeesi mõõtmised pole täpsed
- Nõutav on oluline algproov
- Visualiseerida saab ainult teatud molekule
- Elektroforees on madala läbilaskevõimega
Geelelektroforees on tehnika, kus bioloogilised molekulid eraldatakse üksteisest ja identifitseeritakse bioloogiliste uuringute või meditsiinilise diagnostika käigus. Pärast nende väljatöötamist 1970. aastatel on need meetodid olnud hindamatu väärtusega uuritavate geenide (DNA) ja geeniproduktide (RNA ja valk) tuvastamisel. Viimastel aastatel on ilmnenud uuemad tehnikad, mis annavad elavates süsteemides toimuva kohta suuremat spetsiifikat ja detailsust. Kuigi need ei ole elektroforeesi tehnikaid asendanud ja täiustatud manipulatsioonid võivad tehnika elujõulisust laiendada, on oluline mõista, mida geelelektroforees saab ja mida mitte.
Elektroforeesil on piiratud proovianalüüs
Elektroforees on spetsiifiline kõigi kudede suhtes, millest olete proove võtnud. Näiteks kui teostada põse tampoonil Southern blot (teatud tüüpi elektroforees), vaatad geene põse epiteelirakkudest ja mitte kusagilt muust kehast. Mõnikord võib see olla kasulik, kuid teadlasi huvitavad sageli laiemad mõjud.
Selliste tehnikate abil nagu in situ hübridisatsioon (ISH) võib võtta osa koest ja analüüsida geeni ekspressiooni selle proovi igal väikesel alal.Seega saavad teadlased vaadata ISH-ga proovis kõiki ajupiirkondi, samal ajal kui elektroforeesi tehnikad saavad korraga vaadata ainult mõnda piirkonda.
Elektroforeesi mõõtmised pole täpsed
Geelelektroforees suudab tõhusalt eraldada erineva raskusega sarnaseid valke (seda meetodit nimetatakse Western blotiks). See suudab neid täpsemalt eraldada tehnikaga, mida nimetatakse 2d elektroforeesiks; see on proteoomikas tavaline.
Kahjuks on kõik selle tehnika abil tehtud mõõtmised parimal juhul poolkvantitatiivsed. Valkude täpse massi (massi) saamiseks tuleb pärast valgu puhastamist elektroforeesiga kasutada massispektroskoopiat. Lisaks sõltub erinevate molekulide suhteliste koguste võrdlemine geeli erinevate laikude riba tihedusest (tumedusest). Sellel meetodil on teatud määral viga ja puhaste tulemuste saamiseks võetakse proove tavaliselt mitu korda.
Nõutav on oluline algproov
Elektroforees on tehnika erinevate biomolekulide eraldamiseks ja visuaalseks tuvastamiseks. Selleks juhitakse elektrivool läbi geeli, et eraldada erineva raskusega laetud molekulid. Kui huvipakkuv molekul pole piisavalt tavaline, on selle riba praktiliselt nähtamatu ja seda on raske mõõta.
DNA-d ja RNA-d saab enne elektroforeesi käivitamist mõnevõrra võimendada, kuid seda pole otstarbekas teha valkudega. Seetõttu on nende analüüside tegemiseks vaja suurt koeproovi. See võib piirata tehnika kasulikkust, eriti meditsiinilises analüüsis. Elektroforeesi käivitamine ühe raku proovidest on praktiliselt võimatu; Voolutsütomeetriat ja immunohistokeemiat kasutatakse sagedamini valkude rakkude kaupa ekspressiooni hindamiseks. PCR-nimeline tehnika on suurepärane väikeste RNA koguste mõõtmiseks.
Visualiseerida saab ainult teatud molekule
Elektroforees on keskmise ja suure suurusega biomolekulide eraldamiseks ja identifitseerimiseks suurepärane. Paljud molekulid, mida uurijad soovivad uurida, on siiski väiksemad; väikseid hormoone, neurotransmittereid ja ioone ei saa elektroforeesi abil mõõta. Seda kahel põhjusel: nad ei reageeri korralikult elektroforeesipreparaadiga (tavaliselt SDS PAGE meetodiga) ja isegi kui nad seda teeksid, on nad liiga väikesed, et korralikult eralduda, ja torkaksid geeli põhja välja. Neid molekule mõõdetakse selle asemel selliste meetoditega nagu RIAA (radioimmuunanalüüsid) ja ELISA-d (ensüümiga seotud immunosorbandi test).
Elektroforees on madala läbilaskevõimega
Geeli elektroforees on tavaliselt väikese läbilaskevõimega, st see ei anna andmeid eriti kiiresti. Kontrastne elektroforees, kus saate PCR-i (polümeraasi ahelreaktsiooni) abil vaadata korraga väikest käputäis RNA molekule, millega saab samaaegselt hinnata tuhandeid proove. Samamoodi võib voolutsütomeetria abil võtta mõõtmisi tuhandetest üksikutest rakkudest ja teha keerulisi korrelatsioone, samal ajal kui elektroforees vaatleb rakke massiliselt ega suuda nii täpset diskrimineerimist teha. PCR ja voolutsütomeetria tähistavad vastavalt massiliselt paralleelseid ja jadaprotsesse ning mõlemad ületavad elektroforeesi võime uurimisandmeid genereerida.