Sisu
- Mis on geeli elektroforees?
- Elektroforeesi komponendid
- Geeli vormimine
- Kuidas elektroforees toimib?
- Laeng ja suurus Määrake DNA ribad
- Elektroforeesi rakendused ja kasutamine
Geelelektroforees, mida sageli nimetatakse ka DNA elektroforeesiks või lihtsalt elektroforeesiks, on tehnika, mida kasutatakse DNA fragmentide (ja muude laetud molekulide) eraldamiseks vastavalt suurusele. Selleks kasutatakse fragmente üksteisest eraldamiseks tavaliselt agaroosgeeli ja elektrilaengu abil.
Sellel tehnikal on vähe rakendusi, sealhulgas DNA uurimine, DNA sõrmejälgimine, kriminoloogia ja mitmesugused meditsiinilised rakendused.
Mis on geeli elektroforees?
Geelelektroforees on tehnika, mis võimaldab teadlastel eraldada laetud molekulid vastavalt suurusele. See hõlmab DNA, RNA ja valke.
Pidage meeles, et tänu negatiivselt laetud hapniku molekulidele molekuli suhkru-fosfaadi karkassis on DNA-l ja RNA-l kerge negatiivne laeng. Valkudel võib olla erinevaid laenguid, sõltuvalt polüpeptiidahela aminohapetest.
Elektroforeesi komponendid
Elektroforeesi läbiviimiseks tuleb kõigepealt teha geel. Seda saab teha peaaegu igas laboris; agaroosgeelid on kõige tavalisemad. Geeli valmistamiseks segatakse agaroosipulber spetsiaalse puhvriga, mida nimetatakse elektroforeesipuhvriks. Seejärel kuumutatakse segu seni, kuni agaroos on lahustunud ja segatud täielikult puhverlahuses.
Pange tähele, et mõned elektroforeesi protokollid nõuavad etiidiumbromiidi (Et-Br) lisamist. See värvib elektroforeesis kasutatava DNA, võimaldades teil fragmentide asukohta UV-valguses vaadata.
Geeli vormimine
Seejärel valatakse see ristkülikukujulisse vormi, mida nimetatakse geeli valamiseks. Koos elektroforeesiks kasutatava ristkülikukujulise geeli moodustava vormiga asetatakse geeli ühte otsa kamm. See kamm paneb kaevud, kuhu proovid, mida soovite elektroforeesi teel eraldada, laaditakse. Pilti näete siit.
Kui geel on kõvastunud, eemaldatakse kaevu kamm ja geel asetatakse spetsiaalsesse elektroforeesi mahutisse. Paagis täidetakse veel üks puhver, kuni kerge puhverkiht katab agaroosigeeli täielikult.
See paak tekitab puhverlahuse ja omakorda agaroosgeeli kaudu elektrivoolu (vahemikus 50 kuni 150 V). Agaroosgeeli süvendid asetatakse voolu negatiivsesse otsa (a) katood) geeli teise otsaga voolu positiivses otsas ( anood).
Kuidas elektroforees toimib?
Enne kui elektrivool juhitakse läbi paagi ja geeli, laaditakse teie proovid kaevudesse. Selleks kasutatakse mikropipetti. Markeriproov, tuntud ka kui DNA redel, on teadaolevate DNA fragmentide suurusega proov, mis aitab teil oma proove võrrelda ja mõista testitava proovi suurust.
Sageli a jälgimisvärv (seda nimetatakse ka laadimisvärviks) lisatakse igasse proovi, et aidata teil proovi süvenditesse laadida. Samuti aitab värvaine jälgida proovide liikumist läbi geeli.
Niisiis, kuidas proovid tegelikult liiguvad läbi geeli ja eralduvad suuruse järgi? See on seotud elektrivool mis jookseb läbi agaroosgeeli koos fragmentide suurus / struktuur ja agaroosgeel.
Laeng ja suurus Määrake DNA ribad
Pidage meeles, et üldiselt on DNA laeng negatiivne . Nii et kui need proovid asetatakse kaevudesse, mis asuvad elektrivoolu negatiivse otsa lähedal, põhjustab see negatiivselt laetud DNA liikumist katoodist eemal (negatiivne laeng) ja liikuge anoodi poole (positiivne laeng) vastupidises otsas.
Lisaks proovide sellisele liikumisele eraldab elektroforees proovid ja nendes proovides olevad fragmendid ka suuruse järgi. See on sellepärast, et väiksemad molekulid ja killud võivad liikuge kiiremini ja hõlpsamini läbi geeli suuremad molekulid ja killud liikuge aeglasemalt. See tähendab, et väikesed fragmendid liiguvad geeli lõppu kiiremini kui suuremad ja eraldavad selle tulemusel iga fragmendi suuruse järgi.
Pärast geeli umbes tund kestmist (enamikes protokollides) lülitatakse laadimine välja ja geeli analüüsitakse. Geeli erinevates punktides näete selget ristkülikukujulist riba, mida sageli nimetatakse ka DNA ribaks või valgu ribaks. Iga riba esindab ühte fragmenti, mis on liikunud mööda geeli.
Elektroforeesi rakendused ja kasutamine
Laboris on elektroforeesi jaoks palju rakendusi. Siin on vaid mõned: