Sisu
Raku geneetiline sinine kodeeritakse selle geneetilises materjalis ehk DNA-s. Kuna DNA ei lahku kunagi raku tuumast, on selleks, et see teave satuks tsütoplasmasse, kus asuvad muud valgud ja biokeemilised komponendid, vaja DNA esmalt transkribeerida Messenger RNA-ks (mRNA või polü (A) RNA). Seejärel muundatakse see mRNA valkudeks, mis täidavad raku paljusid funktsioone. Väga haruldaste mRNA-de tuvastamiseks või kvantifitseerimiseks, sondide tegemiseks mikrokiireteks või komplementaarsete DNA molekulide raamatukogude ehitamiseks tuleb mRNA eraldada. RNA (st kogu raku RNA) ekstraheerimine ja sellele järgnev mRNA eraldamine ei ole siiski teineteist välistavad protsessid; esimene tuleb läbi viia mRNA ekstraheerimiseks.
MRNA eraldamine kogu RNA-st
TRIzoli homogeniseerimine: kogu RNA hõlmab kogu mRNA, ülekande RNA, ribosoomi RNA ja muid mittekodeerivaid RNA-sid. Nende teistest rakukomponentidest eraldamiseks purustatakse kärg kõigepealt selle sisu vabastamiseks. Selleks resuspendeeritakse rakud, mis on sadestatud tsentrifuugimisega (ketramine suurel kiirusel) TRIzol Reagentis (Life Technologies). Muud TRIzoli versioonid (näiteks Ambion’s TRI Reagent) töötavad sarnaselt.
RNA täielik eraldamine: raku erinevate komponentide (valgud, DNA, RNA) eraldamiseks suspensioonis kasutatakse tsentrifuugimise seeriat. Ülemine, kollase värvusega faas koosneb rasvast ja võib ära visata. Soovitud faas on punaseks värvitud, sisaldab kogu RNA-d ja säilib. Pärast fenool-kloroformi ekstraheerimist ja mitmeid alkoholipuhastusi, kasutades isopropanooli ja etanooli, saab RNA granuleerida mRNA eraldamiseks. Lisage RNaasi inhibiitoreid, et vältida selle ensüümi kogu RNA lagunemist.
mRNA ekstraheerimine: mRNA-de isoleerimiseks kasutatakse tavalist komplekti, kuna omatehtud laboriprotokollid ei tekita suurtes kogustes kõrgelt puhastatud mRNA-sid. Kommertskomplektide hulka kuuluvad Invitrogen's FastTrack 2.0 või Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Need põhietapid on selliste komplektide jaoks tavalised:
a) Segage komplektis olev RNaasi inhibeeritud lüüsipuhver kuni 300 mikroliitri kogu RNA-ga.
b) Kuumutage 5 minutit temperatuuril 65 ° C ja jahutage proovi viivitamatult ühe minuti jooksul jääl.
c) Segage see 0,5 M naatriumkloriidiga ja lahustage selles proovis Oligo dT (oligodeoksüetümidüülhape) täielikult.
d) Tsentrifuugige see proov ja eraldage supernatant, mida pestakse mitu korda komplektides sisalduvate sidumis- ja madala soolasisaldusega puhvrite seerias.
e) Elueerige mRNA mitu korda, kuni saadakse komplekti määratud maht (nt 500 mikroliitrit).
f) Sadestage eluaat naatriumatsetaadi ja etanooliga sadestamise teel. Resuspendeerige kuni 20 mikroliitrit dietüülpükarbonaadiga (DEPC) töödeldud vees.
g) Hoida temperatuuril -80 kraadi ja kontrollida kvaliteeti ja kogust spektrofotomeetriliselt.