Sisu
- DNA kloonimine: määratlus ja protsessi ülevaade
- Plasmiidvektori meetod
- PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) meetod
- Kasutades plasmiidvektori ja PCR DNA kloonimismeetodeid koos
- Näited DNA kloonimisest biotehnoloogia jaoks
- DNA kloonimise näited uuringute jaoks
- DNA kloonimise näited geeniteraapias
On võimalik kloonida terveid organisme, näiteks lambaid Dolly, kuid DNA kloonimine on erinev. Selle valmistamiseks kasutatakse molekulaarbioloogia tehnikaid identsed koopiad DNA järjestustest või üksikutest geenidest.
Geenitehnoloogiliste meetodite abil tuvastatakse ja eraldatakse DNA geneetilise koodi segmendid. Seejärel kopeerib DNA kloonimine segmentide nukleiinhappejärjestused.
Saadud identseid koopiaid saab kasutada edasisteks uuringuteks või biotehnoloogia rakendusteks. Sageli kodeerib kopeeritud geen valku, mis võib moodustada osa raviprotseduuridest. DNA tehnoloogia, sealhulgas DNA kloonimine toetab arusaamist geenide toimimisest ja sellest, kuidas inimeste geneetiline kood mõjutab keha toimimist.
DNA kloonimine: määratlus ja protsessi ülevaade
DNA kloonimine on molekulaarbioloogia protsess, mille käigus kromosoomides asuvatest DNA segmentidest tehakse identsed koopiad, mis sisaldavad arenenud organismide geneetilist koodi.
Protsessi käigus toodetakse suures koguses sihtmärk-DNA järjestused. DNA kloonimise eesmärk on toota siht-DNA järjestusi ise või toota sihtjärjestustes kodeeritud valke.
DNA kloonimisel kasutatakse kahte meetodit plasmiidivektor ja polümeraasi ahelreaktsioon (PCR). in plasmiidivektor Selle meetodi abil lõigatakse DNA ahelad kasutades restriktsiooniensüümid DNA fragmentide tootmiseks ja saadud segmendid sisestatakse kloonimisvektoritesse, mida nimetatakse plasmiidideks edasiseks dubleerimiseks. Plasmiidid paigutatakse bakterirakkudesse, mis seejärel toodavad DNA koopiaid või kodeeritud valke.
in PCR meetod, märgitakse dubleeritavate DNA ahelate segment ensüümidega, mida nimetatakse praimerid. Polümeraasi ensüüm teeb DNA ahela tähistatud osast koopiad. Selle meetodi puhul ei kasutata restriktsiooniensüüme ja see võib toota väikestest proovidest kloonitud DNA-d. Mõnikord kasutatakse kahte DNA-tehnoloogia meetodit koos, et hõlmata mõlema parimad omadused üldises reaktsioonis.
Plasmiidvektori meetod
Meetodi vektor tähistab plasmiidi, mida kasutatakse kloonitava sihtmärk-DNA segmendi hoidmiseks. Plasmiidid on väikesed ümmargused ahelad mittekromosomaalne DNA leidub paljudes organismides, sealhulgas bakterites ja viirustes.
Bakteriaalsed plasmiidid on vektor, mida kasutatakse sihtmärk-DNA segmendi sisestamiseks bakterirakkudesse edasiseks dubleerimiseks.
Siht-DNA valimine ja eraldamine: Enne DNA kloonimisprotsessi algust tuleb tuvastada DNA järjestused, eriti DNA segmentide algus ja ots.
Selliseid DNA järjestusi saab leida, kasutades olemasolevat tuntud järjestustega kloonitud DNA-d või uurides sihtmärk-DNA järjestuse toodetud valku. Kui järjestus on teada, saab vastavaid restriktsiooniensüüme kasutada.
Siht-DNA lõikamine restriktsiooniensüümidega: Restriktsiooniensüümid valitakse DNA-koodide otsimiseks sihtjärjestuste alguses ja lõpus.
Kui restriktsiooniensüümid leiavad spetsiaalse kodeeritud aluspaaride järjestuse, mida nimetatakse restriktsioonisaitideks, kinnituvad nad selles kohas DNA-ga ja kerivad end ümber DNA molekuli, katkestades ahela. Sihtjärjestust sisaldavad lõigatud DNA segmendid on nüüd dubleerimiseks saadaval.
Plasmiidivektori valimine ja sihtmärk-DNA sisestamine: Sobiv plasmiid sisaldab ideaalis samu DNA kodeerivaid järjestusi kui DNA ahel, millest sihtmärk-DNA lõigati. Plasmiidi ümmargune DNA ahel lõigatakse samade restriktsiooniensüümidega, mida kasutati sihtmärgi DNA lõikamiseks.
A DNA ligaasi ensüüm "DNA segmendi sidumise soodustamiseks" ja sihtmärgi DNA segmendi otsad ühendatakse plasmiidi DNA lõigatud otstega. Siht-DNA moodustab nüüd osa ümmarguse plasmiidi DNA ahelast.
Plasmiidi sisestamine bakterirakku: Kui plasmiid sisaldab kloonitavat DNA järjestust, võib tegelik kloonimine toimuda nn bakteriaalne transformatsioon. Plasmiidid sisestatakse bakterirakku, näiteks E. coli, ja uute DNA segmentidega rakud hakkavad tootma koopiaid ja vastavaid valke.
Bakteriaalse muundamise korral inkubeeritakse peremeesrakke ja plasmiide koos kehatemperatuuril umbes 12 tundi. Rakud absorbeerivad osa plasmiide ja käsitlevad neid omaenda plasmiidse DNA-na.
Kloonitud DNA ja valkude kogumine: Enamikul DNA kloonimiseks kasutatud plasmiididest on antibiootikumiresistentsuse geenid inkorporeeritud nende DNA-sse. Kuna bakterirakud imendavad uusi plasmiide, muutuvad nad antibiootikumide suhtes resistentseks.
Kui kultuuri töödeldakse antibiootikumidega, jäävad ellu ainult need rakud, mis on uued plasmiidid imendunud. Tulemuseks on bakteriaalsete rakkude puhas kultuur kloonitud DNA-ga. Seejärel saab selle DNA koguda või toota vastavat valku.
PCR (polümeraasi ahelreaktsiooni) meetod
PCR-meetod on lihtsam ja kopeerib olemasoleva DNA oma kohale. See ei vaja lõikamist restriktsiooniensüümidega ega plasmiidi DNA järjestuste sisestamist. See teeb selle eriti sobivaks piiratud arvu DNA ahelatega DNA proovide kloonimiseks. Kuigi meetodiga saab DNA kloonida, ei saa seda vastava valgu tootmiseks kasutada.
DNA ahelate lahtirullimine: Kromosoomides olev DNA on tihedalt keerdunud kahekordse spiraalse struktuuriga. DNA kuumutamine temperatuuril 96 ° C protsessil, mida nimetatakse denaturatsioon paneb DNA molekuli kerima ja kaheks ahelaks eralduma. See eraldamine on vajalik, kuna korraga saab kloonida ainult ühte DNA ahelat.
Praimerite valimine: Nagu plasmiidse vektori DNA kloonimisel, tuleb kloonitavad DNA järjestused identifitseerida, pöörates erilist tähelepanu DNA segmentide algusele ja otsadele. Praimerid on ensüümid, mis kinnituvad spetsiifiliste DNA-koodide järjestustega ja need tuleb valida sihtmärk-DNA segmentide märgistamiseks. Õiged praimerid kinnituvad DNA molekuli järjestuste külge, et tähistada sihtsegmentide algust ja lõppu.
Praimerite sidumise reaktsiooni lõõmutamine: Reaktsiooni jahutatakse temperatuurini umbes 55 ° C lõõmutamine. Reaktsiooni jahtumisel aktiveeruvad praimerid ja kinnituvad end DNA ahelaga sihtmärk-DNA segmendi mõlemas otsas. Praimerid toimivad ainult markeritena ja DNA ahelat ei pea lõikama.
Siht-DNA segmendi identsete koopiate tootmine: Protsessis, mida nimetatakse pikendus, reaktsioonile lisatakse kuumutundlik TAQ polümeraasi ensüüm. Seejärel kuumutatakse reaktsioon temperatuurini 72 kraadi Celsiuse järgi, aktiveerides ensüümi. Aktiivne DNA polümeraasi ensüüm seondub praimeritega ja kopeerib nende vahel DNA järjestuse. Esialgne DNA järjestamise ja kloonimise protsess on lõppenud.
Kloonitud DNA saagise suurendamine: Esialgne lõõmutamise ja pikendamise protsess loob saadaolevatest DNA ahela segmentidest suhteliselt vähe koopiaid. Saagise suurendamiseks täiendava DNA replikatsiooni kaudu jahutatakse reaktsioon uuesti, et aktiveerida praimerid ja lasta neil seostuda teiste DNA ahelatega.
Seejärel aktiveerib reaktsiooni uuesti kuumutamine uuesti polümeraasi ensüümi ja saadakse rohkem koopiaid. Seda tsüklit saab korrata 25 kuni 30 korda.
Kasutades plasmiidvektori ja PCR DNA kloonimismeetodeid koos
Plasmiidvektori meetod tugineb plasmiididesse lõikamiseks ja nende sisestamiseks piisaval hulgal DNA varustamist. Liiga vähe originaalset DNA-d põhjustab vähem plasmiide ja aeglast kloonitud DNA tootmise algust.
PCR-meetodiga saab toota suures koguses DNA-d vähestest originaalsetest DNA-ahelatest, kuid kuna DNA-d ei implanteerita bakterirakku, pole valkude tootmine võimalik.
Kloonitavas DNA fragmendis kodeeritud valgu tootmiseks väikesest esialgsest DNA proovist saab neid kahte meetodit kasutada koos ja täiendavad üksteist. Kõigepealt kasutatakse PCR-meetodit DNA kloonimiseks väikesest proovist ja paljude koopiate saamiseks.
Seejärel kasutatakse PCR-i tooteid koos plasmiidse vektori meetodiga toodetud DNA implanteerimiseks bakterirakkudesse, mis toodavad soovitud valku.
Näited DNA kloonimisest biotehnoloogia jaoks
Molekulaarbioloogias kasutatakse geeni kloonimist ja DNA replikatsiooni meditsiinilisel ja ärilisel otstarbel. Kloonitud DNA järjestustega baktereid kasutatakse ravimite tootmiseks ja ainete asendamiseks, mida geneetiliste häiretega inimesed ise ei suuda.
Tüüpilised kasutusalad on järgmised:
Biotehnoloogia kasutab põllumajanduses ka geenide kloonimist, et luua taimedele ja loomadele uusi omadusi või parendada olemasolevaid omadusi. Kuna rohkem geene kloonitakse, suureneb võimalike kasutamiste arv plahvatuslikult.
DNA kloonimise näited uuringute jaoks
DNA molekulid moodustavad väikese osa materjalist elusas rakus ja paljude geenide mõjusid on raske eraldada. DNA kloonimismeetodid annavad uurimiseks suures koguses spetsiifilist DNA järjestust ja DNA toodab valke täpselt nagu algses rakus. DNA kloonimine võimaldab seda operatsiooni uurida eraldatult erinevate geenide osas.
Tüüpilised uuringud ja DNA-tehnoloogia rakendused hõlmavad järgmiste võimaluste uurimist:
Kui kloonitakse rohkem DNA järjestusi, on kergem täiendavaid järjestusi leida ja kloonida. Olemasolevate kloonitud DNA segmentide abil saab kindlaks teha, kas uus segment sobib vanaga ja millised osad on erinevad. Siht-DNA järjestuse tuvastamine on siis kiirem ja täpsem.
DNA kloonimise näited geeniteraapias
Sisse geeniteraapia, kloonitud geen esitatakse organismi rakkudele, mille looduslik geen on kahjustatud. Elutähtsat geeni, mis toodab konkreetse organismi funktsioneerimiseks vajalikku valku, saab muteerida, muuta radiatsioon või mõjutada viirused.
Kui geen ei tööta korralikult, puudub rakul oluline aine. Geeniteraapia proovib asendage geen kloonitud versiooniga, mis annab vajaliku aine.
Geeniteraapia on endiselt eksperimentaalne ja vähesed patsiendid on selle tehnika abil ravitud. Probleemid seisnevad meditsiinilise seisundi eest vastutava üksiku geeni tuvastamises ja geeni paljude koopiate kohaletoimetamises õigetesse rakkudesse. Kuna DNA kloonimine on muutunud laiemaks, on geeniteraapiat rakendatud mitmes konkreetses olukorras.
Viimased edukad rakendused on sisaldanud järgmist:
Geeniteraapia on üks DNA kloonimise paljulubavamaid rakendusi, kuid tõenäoliselt levivad muud uued kasutusviisid, kuna uuritakse rohkem DNA järjestusi ja määratakse nende funktsioon. DNA kloonimine annab vajaliku koguse geenitehnoloogia toorainet.
Kui geenide roll on teada ja nende nõuetekohane funktsioneerimine on tagatud defektsete geenide asendamise kaudu, saab DNA-tehnoloogia abil geneetiliselt rünnata ja ravida paljusid kroonilisi haigusi ja isegi vähki.
Seotud sisu: