Sisu
- Restriktsiooniensüümid ja piirangute saidid
- Õige suund
- Kleepuvate lõppude ligeerimine nõuab vähem DNA-d
- Erinevad ensüümid võivad anda sama kleepuva otsa
Molekulaarne kloonimine on tavaline biotehnoloogia meetod, mida peaksid tundma kõik tudengid ja teadlased. Molekulaarne kloonimine, kasutades teatud tüüpi ensüümi, mida nimetatakse restriktsiooniensüümiks, et lõigata inimese DNA fragmentideks, mida saab seejärel sisestada bakteriraku plasmiidi DNA-sse. Restriktsiooniensüümid lõikavad kaheahelalise DNA pooleks. Sõltuvalt restriktsiooniensüümist võib lõigatud tulemuseks olla kleepuv või tömp ots. Kleepuvad otsad on molekulaarses kloonimises kasulikumad, kuna need tagavad inimese DNA fragmendi sisestamise plasmiidi õiges suunas. Ligeerimisprotsess või DNA fragmentide sulatamine nõuab vähem DNA-d, kui DNA-l on kleepuvad otsad. Lõpuks võivad mitmed kleepuva otsa restriktsiooniensüümid toota sama kleepuvat otsa, isegi kui iga ensüüm tunneb ära erineva restriktsioonijärjestuse. See suurendab tõenäosust, et kleepuvate ensüümide abil saab teie huvipakkuva DNA piirkonna välja lõigata.
Restriktsiooniensüümid ja piirangute saidid
Restriktsiooniensüümid on ensüümid, mis lõikavad ära kaheahelalise DNA spetsiifilised järjestused ja lõikavad DNA selles järjestuses pooleks. Tunnustatud järjestust nimetatakse restriktsioonisaidiks. Restriktsiooniensüüme nimetatakse endonukleaasideks, kuna nad lõikavad kaheahelalise DNA, nagu DNA tavaliselt eksisteerib, kohtades, mis asuvad DNA otste vahel. Seal on rohkem kui 90 erinevat restriktsiooniensüümi. Igaüks tunneb ära eraldi restriktsioonisaiti. Restriktsiooniensüümid lõhustavad oma vastavad restriktsioonisaidid 5000 korda tõhusamalt kui teised saidid, mida nad ei tunne.
Õige suund
Restriktsiooniensüümid jagunevad kahte rühma. Nad lõikavad DNA kleepuvateks või tömpideks otsteks. Kleepuval otsal on lühike nukleotiidide piirkond, DNA ehitusplokid, mis on paarimata. Seda paarimata piirkonda nimetatakse üleulatuks. Üleulatuvus on väidetavalt kleepuv, kuna see soovib ja paaristub teise kleepuva otsaga, millel on komplementaarne üleulatuv järjestus. Kleepuvad otsad on nagu kaua kadunud kaksikud, kes proovivad üksteist tihedalt kallistada, kui nad kohtuvad. Teisest küljest pole nüri otsad kleepuvad, kuna kõik nukleotiidid on juba kahe DNA ahela vahel paaris. Kleepuvate otste eeliseks on see, et inimese DNA fragment mahub bakteriplasmiidi ainult ühes suunas. Vastupidiselt, kui nii inimese DNA-l kui ka bakteriplasmiidil on tömbi otsad, saab inimese DNA sisestada plasmiidi pea-saba või saba-pea suunas.
Kleepuvate lõppude ligeerimine nõuab vähem DNA-d
Ehkki kleepuvate otsadega DNA-l on oma "kleepuvuse" tõttu lihtsam üksteist leida, ei kleepuvate otste ega tömpide otstega sulandu pidevaks DNA tükiks. Pideva, täielikult ühendatud DNA tüki moodustamiseks on vaja ensüümi, mida nimetatakse ligaasiks. Ligased ühendavad nukleotiidide selgroo kleepuvates või tömpides otstes, moodustades pideva nukleotiidide ahela. Kuna kleepuvad otsad leiavad üksteise atraktiivsuse tõttu kiiremini üles, nõuab ligeerimine vähem inimese DNA-d ja vähem plasmiidset DNA-d. DNA ja plasmiidide tömpide otste leidmine on vähem tõenäoline ja seetõttu vajavad tömpide otste ligeerimine katseklaasi rohkem DNA-d.
Erinevad ensüümid võivad anda sama kleepuva otsa
Piirangukohad asuvad kogu organismide genoomis, kuid pole ühtlaselt paigutatud. Plasmiidides saab neid kujundada nii, et need paikneksid otse üksteise kõrval. Teadlased, kes soovivad inimese genoomist inimese DNA fragmendi välja lõigata, peavad leidma fragmendi piirkonna ees ja taga olevad restriktsioonisaidid. Lisaks sellele, et DNA fragment sisestatakse õiges suunas, võivad erinevad kleepuva otsa ensüümid luua sama kleepuva otsa, isegi kui nad tunnevad ära erinevaid restriktsioonijärjestusi. Näiteks on BamHI, BglII ja Sau3A erinevad tuvastusjärjestused, kuid need annavad sama GATC kleepuva otsa. See suurendab tõenäosust, et leidub kleepuvaid restriktsioonisaite, mis ümbritsevad teie huvipakkuvat inimese geeni.