Sisu
Western blot on üks levinumaid protseduure biokeemilistes laborites. Põhimõtteliselt eraldab see valke proovist suuruse järgi, seejärel testitakse antikehade abil, et teha kindlaks, kas antud valku on. See on kasulik mitte ainult teadusuuringutes, vaid ka meditsiini- või diagnostikalaborites; Nii HIV kui ka Lyme'i haiguse testid hõlmavad näiteks ensüümidega seotud immunosorbentide testi (ELISA) testi, millele järgneb Western blot analüüs, kui ELISA test on positiivne. Vaatamata oma populaarsusele on Western blot-meetodil siiski mitmeid puudusi.
Mittekvalitatiivne
Klassikalised Western-blotid on mittekvalitatiivsed. Teisisõnu, kuigi nad saavad teadlastele öelda, kas mingi konkreetne valk on olemas, ei võimalda nad kvantitatiivselt kindlaks teha, kui palju valku on. Mõned biotehnoloogiaettevõtted müüvad nüüd komplekte, mis võimaldavad teadlastel või laboritehnikutel standardkõvera abil kindlaks määrata olemasoleva valgu kogust - kuid see toimib ainult siis, kui saadaval on samast valgust saadud puhtad proovid. Veelgi enam, valgu molekulmassi saab hinnata ainult Western blot analüüsi abil, mitte täpselt määrata nagu massispektromeetriat.
Antikehad
Western blot-analüüsi saab läbi viia ainult siis, kui huvipakkuva valgu vastased antikehad on olemas. Kuigi biotehnoloogiaettevõtetest on saadaval paljude erinevate valkude antikehi, pole need odavad; kui antud valgu jaoks pole primaarsed antikehad saadaval, pole seda konkreetset valku otsiv Western-blot teostamine võimalik. Lisaks võivad teadlased soovida kindlaks teha, kas valku on mingil viisil modifitseeritud - kui see on näiteks fosforüleeritud (näiteks selle külge oli kinnitatud fosfaatrühm) - ja Western blot-meetodi abil vajavad nad modifitseeritud modifitseeritud antikehi valk.
Treening
Western blot'i nõuetekohane läbiviimine ja heade tulemuste saavutamine võib olla keeruline, seetõttu peavad töötajad olema hästi koolitatud.Nii nagu paljudes teisteski, on kogemus võib-olla parim juhendaja; isegi kogenud tehniku jaoks on Western blot siiski aeganõudev. Näiteks eksperimendi geeli elektroforeesi osa võtab tavaliselt aega üks kuni kaks tundi. Muidugi võib geeli töötamise ajal täita ka muid toiminguid, kuid katse võtab tulemuste saamiseks siiski üsna palju aega.
Muud piirangud
Antikehad võivad mõnikord ilmneda väljaspool sihtmärki, mis võib anda halvemaid tulemusi. Lisaks kasutate Western blot-meetodil antikeha konkreetse valgu vastu, nii et teie tulemused annavad teile teada ainult selle valgu olemasolu kohta. Kõrge eraldusvõimega massispektromeetria seevastu paljastab kõik proovis olevad valgud ja erinevalt klassikalisest Western blot-meetodist on see kvantitatiivne. Oluline on muidugi meeles pidada, et massispektromeetria on võrreldes Western blot-meetodiga palju kallim ja tehniliselt keerukam.