Sisu
- Kuidas toimib geeli elektroforees
- Elektroforeesi põhiprotseduur
- Tundmatute fragmentide pikkuste määramine
Rakkude jaoks palju väiksemate DNA fragmentide pikkuse mõõtmiseks vajavad mikrobioloogid trikki ja kõige mugavam on geelelektroforees. See meetod tugineb asjaolule, et DNA fragmendid laetakse, ja see on alternatiiv kallimatele meetoditele, näiteks röntgenkristallograafiale, mis vastutas DNA topeltheeliksi struktuuri avastamise eest.
Kuidas toimib geeli elektroforees
Kuna DNA molekulid on laetud, mõjutab neid elektrivool. Kui seate need neutraalsesse geeli ja asetate voolu üle geeli, migreeruvad molekulid positiivse elektroodi (anoodi) poole. Kuna erineva suurusega DNA molekulid kannavad sama laengut, liiguvad väiksemad kiiremini, seega eraldab see protsess molekulid ribadeks, mida saab võrrelda teadaoleva suurusega proovidega.
Elektroforeesi põhiprotseduur
Geel on tavaliselt valmistatud agaroosist, polüsahhariidist, mis puhverlahuses kuumutamisel moodustab pooltahke, kergelt poorse geeli. Ühest otsast moodustab geel pisikesed süvendid, mida nimetatakse kaevudeks, kuhu teadlane paneb uuritavad DNA proovid koos teadaoleva pikkusega etalonproovidega, mida nimetatakse DNA redeliks. Redelifragmentide pikkused on eelnevalt kindlaks määratud teise meetodi abil, näiteks röntgenkristallograafia abil.
Kui geel on sukeldatud juhtivasse lahusesse ja sellele on rakendatud pinget, hakkavad fragmendid läbi geeli migreeruma - kõigepealt väiksemad ja suuremad, aeglasemad. Lõpuks moodustavad nad vastavalt suurusele end spektritaolisteks ribadeks.
Kui see juhtub, lülitab teadlane toite välja, infundeerib geeli DVA-d siduva värviga ja uurib proove ultraviolettvalguses. Redeli abil referentsina saab teadlane kindlaks teha iga nähtava riba riba fragmendi suuruse. Ainult ribad on nähtavad - üksikud DNA fragmendid on nägemiseks liiga väikesed.
Tundmatute fragmentide pikkuste määramine
Võimalik, et proovis olevad ribad ei ole kõik ribad koos redelil oleva ribaga, nii et teadmata fragmentide suuruse määramiseks joonistavad teadlased tavaliselt graafiku. X-teljel on redeli iga riba läbitud vahemaa millimeetrites, y-teljel aga iga riba suurus. Kui punktid on ühendatud kõveraga, saab mis tahes riba suuruse kõvest ekstrapoleerida pärast selle riba läbitud vahemaa mõõtmist millimeetrites.