Sisu
DNA
Deoksüribonukleiinhape ja valgud. DNA on jaotatud geenideks nimetatavateks üksusteks, millest igaüks kodeerib konkreetset RNA või valgujärjestust. Geene uuritakse elusloodussüsteemide bioloogilise struktuuri ja funktsiooni, evolutsiooni, haiguste ja paljude muude aspektide tundmaõppimiseks. Geenide üksikasjalikuks uurimiseks tuleb DNA isoleerida ja puhastada huvipakkuvatest rakkudest.
DNA ekstraheerimine
Ehkki ühe raku DNA-d saab ekstraheerida ja uurida, ei piisa sellest palja silmaga nägemiseks. Poolimiseks piisava koguse saamiseks tuleb seda rohkem lahtritega paremaga töötada (mitu miljonit).
Täpsed protokollid varieeruvad märkimisväärselt, võttes arvesse konkreetsete proovide unikaalseid omadusi, kuid üldised sammud on homogeniseerimine, lüüsimine, lagundamine, eraldamine ja kogumine. Protseduuri on kõige parem läbi viia väikeses (sõltuvalt proovi suurusest) klaas- või plasttorus.
Proov segatakse või jahvatatakse üldiselt rakkude põhjalikuks eraldamiseks. See muudab raku koostisosad juurdepääsetavamaks reagentidele, mis järgnevad. Seejärel lisatakse homogenaadile puhastusvahendid või ensüümid, et lüüsida rakumembraane (ja tuumamembraane, kui rakud on eukarüootsed), et vabastada DNA. Sel hetkel ümbritseb DNA valke, lipiide, süsivesikuid - kõike muud, mis sisaldus rakkudes.
Valkude lagundamiseks võib olla vajalik täiendav ensümaatiline lagundamine, nii et need ei seo DNA-d ega sega selle kogumist. DNA eraldatakse ülejäänud rakusisaldusest külma, puhta, etüül- või isopropüülalkoholi lisamisega. DNA ei lahustu neis alkoholides, seega kondenseerub, et selle kontakti alkoholiga minimeerida. Seejärel kogutakse kondenseerunud DNA, tavaliselt tsentrifuugimise või spoolimise teel.
DNA poolitamine
DNA kogumine spoolimise teel on efektiivne, kui ekstraheerimise käigus saadakse suur kogus DNA-d. See on ka suurepärane demonstreerimismeetod, kuna puhta DNA muljetavaldav sasipundar on selgelt nähtav.
DNA poolitamiseks tuleb eraldamisetapp hoolikalt läbi viia. Kui see ei olnud osa varem lisatud lüüsireaktiivide segust, tuleb lahusele enne alkoholi lisamise etappi lisada kontsentreeritud soolalahus (naatriumkloriid). Külm alkohol valatakse aeglaselt katseklaasi küljele, moodustades vesilahuse peal kihi, vältides segamist. Kui see õigesti teha, moodustab alkohol soolase kihi peale oma kihi. Siis tuleb spoolimine.
DNA kogumiseks soolasest kihist asetage alkoholikihi kaudu ettevaatlikult klaasist segamisvarras, kuni see puutub toru põhjaga. Keerake varda aeglaselt sõrmede vahel, jälgides kahe kihi vahelist liidest. Kui DNA-d on piisavalt, koguneb see kihtide vahelisse piirkonda kokku, moodustades piimja poolläbipaistva massi. Keerake varda ümber, et ümbritseda DNA (see on spoolimisosa) ja tõmmake see torust välja. DNA võib ladustamiseks või edasiseks analüüsiks viia teise puhta alkoholi tuubi.