Sisu
Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR on tehnika, mille abil kopeeritakse DNA üks fragment paljudeks - eksponentsiaalselt paljudeks - fragmentideks. Esimene samm PCR-is on DNA kuumutamine nii, et see denatureerub või sulab üksikuteks ahelateks. DNA struktuur on nagu trossredel, milles astmed on magnetiliste otstega köied. Magnetid ühenduvad, moodustades astmeid, mida nimetatakse aluspaarideks, ja takistavad seega nende eraldumist. Iga DNA fragment sulab erinevatel temperatuuridel üksikuteks ahelateks. DNA üksikute osade abil DNA struktuuri hoidmine annab ülevaate sellest, miks erinevad DNA fragmendid sulavad erinevatel temperatuuridel ja miks on vaja nii kõrgeid temperatuure.
Sulab! Sulab!
PCR-i esimene samm on DNA sulamine nii, et kaheahelaline DNA eralduks üheahelaliseks DNA-ks. Imetajate DNA puhul hõlmab see esimene samm tavaliselt umbes 95 kraadi Celsiuse järgi (umbes 200 Fahrenheiti). Sel temperatuuril lagunevad vesiniksidemed A-T ja G-C aluspaaride vahel või DNA-redeli treppide vahel, pakkides lahti kaheahelaline DNA. Temperatuur ei ole siiski piisavalt kuum, et murda fosfaat-suhkru selgroog, mis moodustab üksikud ahelad ehk redeli poolused. Üksikute ahelate täielik eraldamine valmistab need ette PCR-i teiseks etapiks, mis jahutatakse, võimaldades lühikestel DNA fragmentidel, mida nimetatakse praimeriteks, üksikute ahelate sidumiseks.
Magnetilised tõmblukud
Üks põhjus, miks DNA kuumutatakse kõrgele temperatuurile (95 kraadi Celsiuse järgi), on see, et mida pikem on DNA topeltside, seda enam tahab ta koos püsida. DNA pikkus on üks tegur, mis mõjutab selle DNA tüki PCR-i jaoks valitud sulamistemperatuuri. A-T ja G-C aluspaarid on kaheahelalises DNA-sidus omavahel, et hoida kaheahelaline struktuur koos. Mida rohkem on järjestikuseid aluspaare kahe üksiku ahela vahel omavahel sidunud, seda rohkem tahavad ka nende naabrid omavahel siduda ja seda tugevamaks muutub kahe ahela vaheline külgetõmme. See on nagu väikestest magnetitest valmistatud tõmblukk. Tõmblukuga sulgedes tahavad magnetid loomulikult tõmblukku jääda ja tõmblukuks jääda.
Tugevamad magnetid kleepuvad tihedamalt
Veel üks tegur, mis mõjutab seda, millist sulamistemperatuuri teie huvipakkuva DNA fragmendi jaoks valida, on selles fragmendis sisalduvate G-C aluspaaride hulk. Iga aluspaar on nagu kaks minimagneti, mis köidavad. G- ja C-paar on palju tugevamalt ligitõmbav kui A- ja T-paar. Seega vajab DNA tükk, milles on rohkem G-C paare kui teises fragmendis, enne üksikuteks ahelateks sulamist kõrgemat temperatuuri. DNA neelab ultraviolettvalgust loomulikult - kui täpsus on lainepikkusel 260 nanomeetrit - ja üheahelaline DNA neelab rohkem valgust kui kaheahelaline DNA. Nii et neeldunud valguse mõõtmine on viis, kuidas mõõta, kui palju on teie kaheahelaline DNA sulandunud üksikuteks ahelateks. G-C ja A-T aluspaaride "magnetilise tõmblukuga" efekt põhjustab temperatuuri tõusu suhtes kaheahelalise DNA valguse neeldumise graafiku sigmoidset, S-kujulist ja mitte sirget joont. S kõver tähistab meeskonnatöö takistust, mida aluspaarid avaldavad kuumusele, kuna nad ei soovi eralduda.
Poole tee
Temperatuuri, mille jooksul DNA pikkus sulab üksikuteks ahelateks, nimetatakse selle sulamistemperatuuriks, mida tähistatakse lühendiga “Tm”. See näitab temperatuuri, mille juures pool lahuses sisalduvast DNA-st on sulanud üksikuteks ahelateks ja teine pool on ikka topeltsideme kujul. Sulamistemperatuur on iga DNA fragmendi jaoks erinev. Imetajate DNA G-C sisaldus on 40%, mis tähendab, et ülejäänud 60% aluspaaridest on As ja Ts. Selle 40% G-C sisaldus põhjustab imetajate DNA sulamist 87 kraadi Celsiuse järgi (umbes 189 Fahrenheiti). Seetõttu on imetajate DNA PCR-i esimene samm kuumutada seda temperatuurini 94 ° C (201 Fahrenheiti). Vaid seitse kraadi kuumem kui sulamistemperatuur ja kõik kahekordsed ahelad sulavad täielikult üksikuteks ahelateks.