Sisu
- TL; DR (liiga pikk; ei lugenud)
- Puhver ja sool
- Pesemisvahendite lahustamine
- Kelaativad ained ja inhibiitorid
- Leeliseline lüüs
Lüüs on sõna, mis pärineb kreeka keelest ja tähendab lihtsalt "poolitama" või "lõhkema". Tavaliselt puudutavad terminid seda, mis juhtub rakkudega lüüsipuhvris - lahenduses, mis murrab need lahti sisu väljavõtmiseks. Teadlased kasutavad DNA või valkude ekstraheerimiseks rakkudest analüüsimiseks lüüsipuhvreid, eriti bakterite puhul. Rakkude lüüsipuhvri tüüp varieerub sõltuvalt katse liigist, ehkki järgmised on mõned levinumad valikud.
TL; DR (liiga pikk; ei lugenud)
Lüüsipuhvrid aitavad avatud rakke lõhkuda, nii et nende sisule pääseb juurde või eemaldatakse. Mõned näited hõlmavad sooli, detergente, kelaativaid aineid ja inhibiitoreid ning mõnda aluselist kemikaali.
Puhver ja sool
Puhvrid stabiliseerivad pH, samal ajal kui rakud jagunevad. Tris-HCL on üks levinumaid kemikaale puhverdamiseks pH juures 8. HEPES on neis katsetes veel üks levinud puhverkemikaal. Naatriumkloriidsool võib tõsta ka ioontugevust, lahustite üldkontsentratsiooni väljaspool rakke. Sellel viimasel punktil on teatav tähtsus, kuna vesi võib hajuda rakumembraanides madala lahustunud aine kontsentratsiooniga piirkondadest kõrge lahustunud kontsentratsiooni piirkondadeni.
Pesemisvahendite lahustamine
Pesuained lahustavad rakumembraane, nii et rakkude sisu pääseb välja. Sellel on ja amfipaatne molekulaarstruktuur (s.o molekulid, mille üks ots reageerib veemolekulidega hõlpsalt, samas kui teine hüdrofoobne või "vett kardav" ots ei ole). Nad võivad rasvu lahustada, moodustades mitsellid, väikesed kobarad, kus puhastusvahendi molekulide hüdrofoobsed sabad on suunatud rasvamolekulide poole. Tavaliste detergentide hulka kuuluvad naatriumdodetsüülsulfaat ehk SDS, NP-40 ja tritonX.
Kelaativad ained ja inhibiitorid
Lüüsipuhvrid hõlmavad tavaliselt ka kelaativaid aineid nagu etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA) või etüleenglükool-tetraäädikhape (EGTA). Need kemikaalid seonduvad metalliioonidega kahe positiivse laenguga (nt magneesium ja kaltsium), muutes need muude reaktsioonide jaoks kättesaamatuks. Paljud DNA-d (valgud, mis närivad DNA-d) ja proteaasid (valgud, mis lõhestavad muid valke) vajavad toimimiseks magneesiumi ioone, nii et EDTA ja EGTA, võtmata neile seda võtmekoostist, aitavad vähendada proteaasi või DNAse aktiivsuse taset. Nad ei välista seda täielikult ja mõned proteaasid ei sõltu magneesiumi kofaktoritest, nii et lüüsipuhvrid sisaldavad mõnikord ka kemikaale, mida nimetatakse proteaasi inhibiitoriteks, mis seostuvad proteaasidega ja takistavad nende nõuetekohast toimimist.
Leeliseline lüüs
Leeliseline lüüs - väga levinud meetod plasmiidide puhastamiseks bakteritest - hõlmab kolme lahust. Esimene neist sisaldab glükoosi, tris-HCL puhvrit, EDTA ja RNAsse. Glükoos tekitab väljaspool baktereid suure lahustunud aine kontsentratsiooni, nii et need muutuvad pisut lõtvaks, mis muudab nende lüüsimise lihtsamaks. EDTA ja tris-HCL toimivad nagu juba kirjeldatud, samal ajal kui RNAaas närib raku sees olevat RNA-d, et see teelt välja pääseda. Teine lahendus lüüsib rakud tegelikult. See sisaldab SDS-i detergenti ja NaOH-d, mis tõstab pH taseme 12-ni või üle selle, denatureerivad rakus olevad valgud ja põhjustavad DNA eraldumist üksikuteks ahelateks. Kolmas lahus sisaldab kaaliumatsetaati, et taastada pH väärtus neutraalsemale tasemele, et plasmiidi DNA ahelad saaks tagasi kokku tulla. Vahepeal denatureeritud valgud kogunevad ja sadestuvad, samal ajal kui dodetsüülsulfaatioonid koos kaaliumioonidega moodustavad lahustumatu ühendi, mis sadestub ka lahusest.