Sisu
Kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) töötamisel on usaldusväärse ja kvaliteetse tulemuse tagamiseks hädavajalik hea kalibreerimine. HPLC-seadme õige kalibreerimine algab sobiva kalibreerimisstandardi koostamisega. Enamikul juhtudel nõuab kalibreerimine tegelikult rea kontsentratsiooni suurendamise norme, et saada nn kalibreerimiskõver. See on graafikujoon ja sellega seotud võrrand, mis kirjeldab seost uuritava kemikaali kontsentratsiooni ja HPLC detektori reageeringu vahel.
Määrake kemikaal, mida soovite HPLC abil testida ("analüüt"). Näiteks võiksite proovida karastusjookide sarja fruktoosisisalduse osas, sel juhul oleks analüüsitavaks tooteks fruktoos.
Hankige piisava puhtusega analüüdi kemikaali kogus. Tavaliselt peaks puhtus olema üle 99% ja analüüt tuleks osta tuntud kemikaalide tarnimisettevõttelt. Fruktoosi puhul ostaksite puhast fruktoosi näiteks kemikaalide müüjalt, mitte toidupoest.
Määrake analüüdi maksimaalne ja minimaalne eeldatav kontsentratsioon proovides, mida kavatsete HPLC abil testida. Karastusjookide puhul uuriksite jookide silte ja teeksite testitavate jookide hulgast madalaima ja kõrgeima fruktoosisisalduse. Pidage meeles, et esialgset proovi (karastusjooki) võib analüüsideks ettevalmistamise ajal lahjendada või muul viisil manipuleerida (sõltuvalt kasutatavast HPLC meetodist) ja nii võib muuta analüüdi kontsentratsiooni HPLC-le tegelikult süstitud proovides. Arvesse tuleb võtta analüüdi kontsentratsiooni proovides, mis töödeldakse HPLC abil.
Kalibreerimisstandardite saamiseks määrake lahusti, milles te oma analüüdi lahustate. See lahusti peab suutma analüüti korralikult lahustada suhteliselt laia kontsentratsioonivahemiku piires (vähemalt sama kõrge kui proovides, mida kavatsete katsetada). Samuti peaks see lahusti ideaaljuhul olema üsna sarnane "liikuva faasiga": lahustile, mida kasutati proovide viimiseks läbi HPLC seadme.
Arvutage analüüdi kogus, mis on vajalik analüüdi põhivarustuse lahuse saamiseks. See leitakse, korrutades põhistandardi nõutava kontsentratsiooni soovitud mahuga. Analüüdi kontsentratsioon selles lahuses peaks olema vähemalt 10% kõrgeim kui proovi kõrgeim eeldatav kontsentratsioon. Kui karastusjoogiproovis on kõrgeim eeldatav fruktoosikontsentratsioon 8 grammi / 100 milliliitrit, siis võib põhistandardiks teha kontsentratsiooni 10 grammi fruktoosi / 100 milliliitrit. Mõistlik maht on 500 milliliitrit, seega oleks vaja 8/100 ml x 500 ml = 40 grammi fruktoosi.
Kaalutakse vajalik kogus analüüti sobiva täpsusastmeni. Sageli on sobiv ühe või kahe kümnendkoha täpsusega kaal grammides, kuid mõne meetodi puhul võib olla vajalik täpsus.
Viige kaalutud analüüt vajaliku mahuga mõõtekolbi ja lisage soovitud lahusti kolvi täitumismärki. Mõõtekolbi (näiteks mõõteklaasi asemel) kasutamine suurendab lähtestandardi kontsentratsiooni väärtuse täpsust. Veenduge, et kogu analüüt kantakse kolbi; vajadusel peske seda osa lahustist.
Mõõtekolb suletakse korgiga ja loksutatakse või keeratakse ettevaatlikult, kuni analüüsitav aine on täielikult lahustunud.
Põhivarustuse standardi lahjenduste seeria viiakse läbi, kandes lähtestandardi teadaolevad kogused mõõtekolbidesse, kasutades pipeti abil täpset ülekandmist, lisades seejärel lahusti. Madalaim standardkontsentratsioon peaks olema madalam kui eeldatav analüüsitav proov. Karastusjookide näites, kui madalaim eeldatav fruktoosi kontsentratsioon proovis on 2 grammi / 100 ml, võiks teha 1 grammi / 100 ml normi. Seda teeks aktsiastandardi kümnekordne lahjendamine. Standardseeria peaks sisaldama kokku 5 või 6 kontsentratsiooni, seega oleks vaja täiendavaid lahjendusi, et saada norme 3, 5 ja 8 grammi fruktoosi / ml. Nüüd on teil HPLC kalibreerimiseks rida standardlahendusi.