Sisu
- Genoomika ja DNA järjestamine
- DNA järjestamise määratlus
- DNA järjestus: varane uurimine
- Sangeri suurim eesmärk oli suuremahuliste tervete genoomide sekveneerimine, kuid väiksema bakteriofaagi aluspaaride sekveneerimine oli kahvatu võrreldes inimese genoomi 3 miljardi aluspaari sekveneerimisega. Sellegipoolest oli madal bakteriofaagi kogu genoomi järjestamise õppimine oluline samm kogu inimese genoomi kokku koondamiseks. Kuna DNA ja kromosoomid koosnevad miljonitest aluspaaridest, enamus sekveneerimismeetoditest eraldab DNA väikesteks ahelateks ja seejärel torgatakse DNA segmendid kokku; see võtab lihtsalt aega või kiireid, keerukaid masinaid.
- DNA järjestamise põhitõed
- DNA järjestamise meetodid: Sangeri meetodid
- Veel üks põnev edasiarendus oli haavlipüsside meetod, mis juhuslikult proovis ja sekveneeris kuni 700 aluspaari korraga. Sanger on tuntud ka selle poolest, et kasutab dideoksü (dideoksünukleotiid) meetodit, mis lisab DNA sünteesi ajal ahelat lõpetava nukleotiidi, et märgistada analüüsimiseks DNA lõigud. Dideoksünukleotiidid lõhustavad DNA polümeraasi aktiivsust ja takistavad nukleotiidide moodustumist DNA stringi.
- DNA järjestamise sammud
- DNA järjestuse määramise tehnoloogia areng
- Inimgenoomi projekt
- Muud DNA järjestamise näited
- DNA järjestamise eetilised mõjud
Nukleotiidid on elu keemilised ehitusplokid ja neid leidub elusorganismide DNA-s. Iga nukleotiid koosneb suhkur, fosfaat ja a lämmastikku sisaldav alus: adeniin (A), tümiin (T), tsütosiin (C) ja guaniin (G). Nende nukleotiidialuste konkreetne järjekord määrab, millised valgud, ensüümid ja molekulid rakk sünteesitakse.
Nukleotiidide järjekorra või järjestuse kindlaksmääramine on oluline mutatsioonide, evolutsiooni, haiguse progresseerumise, geenitestide, kohtuekspertiisi ja meditsiini uurimiseks.
Genoomika ja DNA järjestamine
Genoomika on DNA, geenide, geenide vastastikmõju ja geenide keskkonnamõjude uurimine. Geenide keeruka sisemise töö lahtiharutamise saladus on nende genoomi struktuuri ja asukoha tuvastamine kromosoomides.
Elusorganismide sinine määratakse DNA nukleiinhapete aluspaaride järjestuse (või järjestuse) järgi. Kui DNA replitseerub, paarituvad adeniin tümiiniga ja tsütosiin guaniiniga; mittevastavaid paare peetakse mutatsioonid.
Pärast topeltheeliksi desoksüribonukleiinhappe (DNA) molekuli konstrueerimist 1953. aastal on genoomika ja suuremahulise DNA järjestamise valdkonnas tehtud dramaatilisi parandusi. Teadlased töötavad usinasti selle nimel, et neid uusi teadmisi haiguste individuaalseks raviks rakendada.
Samal ajal võimaldavad käimasolevad arutelud teadlastel sammu pidada nii kiiresti plahvatava tehnoloogia eetiliste tagajärgedega.
DNA järjestamise määratlus
DNA järjestamine on protsess, mille käigus avastatakse erinevate nukleotiidide aluste järjestus DNA lõikudes. Terve geeni järjestamine võimaldab võrrelda kromosoome ja genoome, mis esinevad samades ja erinevates liikides.
Kromosoomide kaardistamine on teaduslikuks uurimiseks kasulik. Geenide, alleelide ja kromosomaalsete mutatsioonide mehhanismide ja struktuuri analüüsimine DNA molekulides soovitab uusi võimalusi geneetiliste häirete ravimiseks ja näiteks vähkkasvaja kasvu peatamiseks.
DNA järjestus: varane uurimine
Frederick Sangeri DNA sekveneerimise meetodid aitas 1970. aastatest alates märkimisväärselt edasi genoomika valdkonda. Pärast RNA edukat järjestamist insuliini uurimisel tundis Sanger valmis tegeleda DNA sekveneerimisega. Sanger polnud esimene teadlane, kes DNA sekveneerimisega tegeles. Tema nutikad DNA-järjestusmeetodid - mis töötati välja koos kolleegide Bergi ja Gilbertiga - pälvisid 1980. aastal aga Nobeli preemia.
Sangeri suurim eesmärk oli suuremahuliste tervete genoomide sekveneerimine, kuid väiksema bakteriofaagi aluspaaride sekveneerimine oli kahvatu võrreldes inimese genoomi 3 miljardi aluspaari sekveneerimisega. Sellegipoolest oli madal bakteriofaagi kogu genoomi järjestamise õppimine oluline samm kogu inimese genoomi kokku koondamiseks. Kuna DNA ja kromosoomid koosnevad miljonitest aluspaaridest, enamus sekveneerimismeetoditest eraldab DNA väikesteks ahelateks ja seejärel torgatakse DNA segmendid kokku; see võtab lihtsalt aega või kiireid, keerukaid masinaid.
DNA järjestamise põhitõed
Sanger teadis oma töö potentsiaalset väärtust ja tegi sageli koostööd teiste teadlastega, kes jagasid tema huve DNA, molekulaarbioloogia ja bioteaduste alal.
Ehkki Sangeri DNA sekveneerimismeetodid on tänapäevaste sekveneerimistehnoloogiatega võrreldes aeglased ja kallid, kiideti toona Sangeri DNA sekveneerimise meetodeid. Pärast katse-eksituse meetodit leidis Sanger salajase biokeemilise „retsepti“ DNA ahelate eraldamiseks, suurema DNA loomiseks ja nukleotiidide järjekorra tuvastamiseks genoomis.
Kvaliteetseid materjale saab laboriuuringutes kasutamiseks hõlpsalt osta:
DNA järjestamise meetodid: Sangeri meetodid
Sanger mõtles välja, kuidas ensüümi DNA polümeraasi abil lõigata DNA väikesteks segmentideks.
Seejärel tegi ta mallist rohkem DNA-d ja sisestas uude DNA-sse radioaktiivsed jäljendid eraldatud ahelate lõikude piiritlemiseks. Samuti mõistis ta, et ensüüm vajab praimerit, mis võib seostuda matriitsi ahela konkreetse punktiga. 1981. aastal tegi Sanger taas ajalugu, selgitades välja mitokondriaalse DNA 16 000 aluspaari genoomi.
Veel üks põnev edasiarendus oli haavlipüsside meetod, mis juhuslikult proovis ja sekveneeris kuni 700 aluspaari korraga. Sanger on tuntud ka selle poolest, et kasutab dideoksü (dideoksünukleotiid) meetodit, mis lisab DNA sünteesi ajal ahelat lõpetava nukleotiidi, et märgistada analüüsimiseks DNA lõigud. Dideoksünukleotiidid lõhustavad DNA polümeraasi aktiivsust ja takistavad nukleotiidide moodustumist DNA stringi.
DNA järjestamise sammud
Temperatuuri tuleb kogu sekveneerimise ajal hoolikalt reguleerida. Esiteks lisatakse katseklaasi kemikaalid ja kuumutatakse kaheahelalise DNA molekuli lahti harutamiseks (denatureerimiseks). Seejärel temperatuur jahutatakse, lastes praimeril siduda.
Järgmisena tõstetakse temperatuuri, et soodustada DNA polümeraasi (ensüümi) optimaalset aktiivsust.
Polümeraas kasutab tavaliselt saadaolevaid tavalisi nukleotiide, mida lisatakse kõrgemas kontsentratsioonis.Kui polümeraas jõuab värvatud aheldatud nukleotiidini „ahelaga lõppev”, peatub polümeraas ja ahel lõpeb seal, mis selgitab, miks värvitud nukleotiide nimetatakse „ahela lõpevaks” või „terminaatoriks”.
Protsess jätkub palju-mitu korda. Lõpuks on värvainega seotud nukleotiid paigutatud DNA järjestuse igasse kohta. Geelelektroforees ja arvutiprogrammid võimaldavad seejärel tuvastada DNA-ahelate värvainevärvid ja värvaine, värvaine asukoha ja ahelate pikkuse põhjal välja mõelda kogu DNA jada.
DNA järjestuse määramise tehnoloogia areng
Suure jõudlusega järjestamine - üldiselt viidatud kui järgmise põlvkonna sekveneerimine - kasutab uusi edusamme ja tehnoloogiaid nukleotiidide aluste järjestuse kiiremaks ja odavamaks järjestamiseks kui kunagi varem. DNA-sekveneerimismasin saab hõlpsasti hakkama suuremahuliste DNA-lõikudega. Tegelikult saab Sangeri järjestamistehnikatega aastate asemel kogu genoomi teha mõne tunniga, mitte aastate jooksul.
Järgmise põlvkonna sekveneerimismeetoditega saab hakkama suuremahulises DNA analüüsis ilma täiendava amplifikatsiooni või kloonimiseta, et saada sekveneerimiseks piisavalt DNA-d. DNA-sekveneerimismasinad käivitavad korraga mitu järjestusreaktsiooni, mis on odavam ja kiirem.
Põhimõtteliselt juhib uus DNA sekveneerimise tehnoloogia sadu Sangeri reaktsioone väikesel, kergesti loetaval mikroskeemil, mida juhitakse seejärel järjestuse kokku pandava arvutiprogrammi kaudu.
Tehnika loeb lühemaid DNA fragmente, kuid see on siiski kiirem ja tõhusam kui Sangeri sekveneerimismeetodid, nii et isegi suuremahulised projektid saab kiiresti lõpule viia.
Inimgenoomi projekt
Inimese genoomi projekt, valminud 2003. aastal, on üks kuulsamaid seni tehtud sekveneerimise uuringuid. 2018. aasta artikli kohaselt Teadusuudised, koosneb inimese genoom umbes 46 831 geeni, mis oli järjekorra jaoks suur väljakutse. Tippteadlased kogu maailmast veetsid peaaegu kümme aastat koostööd ja nõustamist. Inimese genoomi uuringu eestvedaja
Instituudis kaardistas projekt anonüümsetelt doonoritelt võetud liitproovi abil edukalt inimese genoomi.
Inimese genoomi projekt põhipaaride kaardistamiseks tugines bakteriaalsete kunstlike kromosoomide (BAC-põhistele) järjestamismeetoditele. Selle tehnika abil kasutati DNA fragmentide kloonimiseks baktereid, mille tulemuseks oli sekveneerimiseks suures koguses DNA-d. Seejärel vähendati kloonide suurust, asetati sekveneerimismasinasse ja monteeriti inimese DNA-sid esindavateks osadeks.
Muud DNA järjestamise näited
Uued avastused genoomikas muudavad põhjalikult haiguste ennetamise, avastamise ja ravi lähenemisviise. Valitsus on eraldanud miljardeid dollareid DNA-uuringutele. Korrakaitse tugineb juhtumite lahendamisel DNA-analüüsile. DNA-testimiskomplekte saab osta koduseks kasutamiseks, et uurida esivanemaid ja tuvastada terviseohtlikke geenivariante:
DNA järjestamise eetilised mõjud
Uute tehnoloogiatega kaasneb sageli nii sotsiaalse kasu kui ka kahju tekkimine; näited hõlmavad talitlushäiretega tuumaelektrijaamu ja massihävitusrelvi. DNA-tehnoloogiatega kaasnevad ka riskid.
Emotsionaalsed mured seoses DNA järjestamise ja geeni redigeerimise tööriistadega, näiteks CRISPR, hõlmavad hirmu, et see tehnoloogia võib hõlbustada inimeste kloonimist või viia petlike teadlaste loodud mutantsete transgeensete loomade juurde.
Sagedamini on DNA sekveneerimisega seotud eetilised probleemid seotud teadliku nõusolekuga. Kerge juurdepääs tarbija otsesele DNA-testimisele tähendab, et tarbijad ei pruugi täielikult mõista, kuidas nende geneetilist teavet kasutatakse, säilitatakse ja jagatakse. Kohalikud inimesed ei pruugi olla emotsionaalselt valmis tundma oma puudustega geenivariante ja terviseriske.
Kolmandad isikud, näiteks tööandjad ja kindlustusettevõtted, võivad potentsiaalselt diskrimineerida inimesi, kellel on defektsed geenid, mis võivad põhjustada tõsiseid meditsiinilisi probleeme.